188金宝博,金宝博官方网站,金宝博APP下载课题组前期采用棘孢木霉DQ-1灌根处理番茄根时，发现番茄的抗病性会短暂的下降，之后便被诱导增强，据此通过高通量测序技术，筛选并鉴定到一个关键的microRNA like RNA：Tra-milR1。研究发现，该milRNA在与棘孢木霉相似的五个物种（类棘孢木霉、钩状木霉、深绿木霉、盖姆斯木霉及拟康宁木霉）中均存在同源milRNA，表明该milRNA较为保守，并且在与番茄互作过程中特异性表达（图1）。

　　图1.木霉与番茄互作过程中Tra-milR1的鉴定。a：木霉全基因组水平系统发育树b：木霉前体Tra-milR1的酸序列比对c：前体Tra-milR1的二级结构预测。d：木霉与番茄互作过程中Tra-milR1的Northern blot检测。

　　研究进一步发现，Tra-milR1存在于木霉-番茄互作的外泌体中，并且在互作过程中可以与宿主Ago蛋白SlyAgo1结合，说明该milRNA通过外泌体进入番茄根系，并与SlyAgo1结合，行驶功能（图2）。同时通过过表达及短串联靶标（STTM）技术构建Tra-milR1过表达、沉默菌株，发现这些突变株与番茄根部互作过程中，根部定植木霉生物量显著改变，表明该milRNA与木霉定植高度相关。

　　图2.棘孢木霉DQ-1通过细胞外囊泡（EVs）将Tra-milR1分泌到番茄中，并在相互作用过程中通过与SlyAGO1结合劫持宿主RNAi机制。a：外泌体提取方法。b：EVs的透射电子显微镜图像，比例尺为200 nm。c：提取的EV中Tra-milR1的Northern blot分析。d：互作过程中SlyAgo1、SlyAgo2的免疫沉淀。

　　该研究进一步鉴定了该milRNA在番茄内的靶标mRNA , 其中SlyChit4，一个编码内切几丁质酶的蛋白被鉴定为Tra-milR1的靶基因。其中SlyChit4高度影响了木霉定植于番茄根部的进程、过表达株系根部在互作中期（40hpi）仅有少量木霉孢子附着，但在敲除株系中，早期（8hpi）就发现了大量孢子附着并生长定植。此外，将Tra-milRNA1在番茄内部表达，展现出了SlyChit4敲除株系一致的表型，说明Tra-milR1进入番茄内部通过抑制SlyChit4的表达来抑制番茄的免疫，从而影响木霉的定植（图3）。为了进一步探究SlyChit4的功能，通过转录组测序发现，SlyChit4的过表达影响了JA、ET、SA等多个防卫相关通路，从而影响番茄的免疫。同时将SlyChit4原核表达，发现该蛋白可以降解木霉细胞壁内的几丁质，从而抑制木霉孢子的萌发及生长。

　　图3.SlyChit4在相互作用的早期阶段抑制木霉菌定植。a：共聚焦显微镜观察显示，在互作过程中，木霉孢子在WT、OE-SlyChit4、KO-SlyChit4和Tra-milR1过表达株系根表面的粘附和生长。b：在互作过程中，木霉在不同番茄根系内定植的生物量。

　　综上所述，该研究揭示了木霉早期通过Tri-miR1进入番茄根部，挟持番茄Ago蛋白SlyAgo1，抑制宿主免疫基因SlyChit4的表达从而抑制番茄免疫，促进了其在宿主根部的定植，并明确了SlyChit4不仅作为免疫相关基因，同时也可以通过降解木霉细胞壁，从而抑制木霉的生长，在定植后期，木霉通过分泌效应蛋白，从而激活番茄的免疫基因表达（图4）。该研究增进了木霉作为生防菌早期逃避宿主免疫机制的理解，也为真菌milRNA的农业可持续应用提供了新思路。

　　在读博士研究生薛鸣，王睿副教授及侯巨梅副教授为该论文的共同一作，刘铜教授为通讯作者。课题组林润茂副研究员、博士后Raja Asad Ali Khan，上海交通大学陈捷教授，南京农业大学赵弘巍教授以及海南大学王琳副教授参与了项目研究。该研究得到了国家自然科学基金委项目的资助。

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